细胞凋亡检测在生命科学研究中占据着重要地位，广泛应用于疾病机制研究、药物筛选等多个领域。本文将详细介绍如何使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测，帮助科研人员更好地理解细胞死亡过程。

实验原理

在细胞凋亡的早期阶段，细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸（PS）会从胞质转移至细胞外，导致细胞膜的通透性增加。此时，细胞膜外侧的PS被Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白Annexin-V特异性地标记。Annexin-V与PS的结合力极强，而PI（碘化丙啶）则是一种经济、稳定的核酸染料，它无法穿透正常细胞或早期凋亡细胞的完整细胞膜，却能进入晚期凋亡或坏死细胞，使其细胞核变红。当Annexin-V与PI联合使用时，活细胞和早期凋亡细胞不会被PI染色，而晚期凋亡和坏死细胞则会同时被FITC和PI染色，呈现双阳性。

实验材料准备

1. AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒
2. 细胞样本（悬浮细胞或贴壁细胞）
3. 离心机
4. PBS
5. 荧光显微镜或流式细胞仪

实验方法

1. 细胞收集

悬浮细胞：以1000g离心5分钟，弃去上清。加入1mL预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，再次以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。
贴壁细胞：小心吸取细胞培养液并保存。用PBS洗涤后，加入适量不含EDTA的胰酶消化液，消化细胞。加入先前收集的培养液，轻轻吹打混匀制成单细胞悬液，并以1000g离心5分钟，弃去上清。然后加入1mL预冷的PBS重悬细胞沉淀，最后以1000g离心5分钟，弃去上清，保留细胞沉淀。

2. 重悬细胞

将细胞沉淀加入195μL Binding Buffer，轻轻重悬至适宜浓度。

3. 加入染料

① 加入5μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀，用于检测早期凋亡细胞（PS外翻）。
② 加入10μL PI Stain，轻轻混匀，用于检测晚期凋亡或坏死细胞（DNA染色）。

4. 孵育

在室温下避光孵育10-20分钟，以确保染料与细胞充分结合。

检测与分析

流式细胞仪检测

1. 设置适当的通道以检测AnnexinV-FITC和PI的荧光信号。
2. 设置三组对照，以便校正背景信号并确定凋亡细胞的比例：
  - 未染色组：用于检测自然荧光。
  - PI单染组：用于确定PI的阳性阈值。
  - AnnexinV-FITC单染组：用于确定AnnexinV的阳性阈值。

荧光显微镜检测

1. 离心后用少量Binding Buffer重悬细胞，制备涂片。
2. 在荧光显微镜下观察，通常AnnexinV-FITC显现绿色荧光，PI显现红色荧光。
3. 可通过拍照或计数进行凋亡细胞的定量分析。

注意事项

1. 整个操作过程中应保持低温，以减少细胞代谢和自发荧光。
2. 避免长时间暴露在光线下，特别是FITC类染料，因为光照会导致荧光淬灭。
3. 根据实验需求调整细胞数量和染料浓度。
4. 使用流式细胞仪时，请确保仪器已经校准并且通道设置准确。

通过使用PG电子的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，科研人员能够更加高效、准确地检测和分析细胞凋亡，助力生物医学领域的研究进展。